关于达克替尼/多泽润在脑肿瘤中的临床试验数据

　　细胞系和培养条件

　　人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和人髓母细胞瘤细胞系Daoy购自美国典型培养物保藏中心。用逆转录病毒转导U87MG细胞以表达绿色荧光蛋白（GFP）和嘌呤霉素乙酰转移酶荧光素酶融合蛋白。还使用MSCV-ires-pacLuc2逆转录病毒转导Daoy细胞以表达荧光素酶。髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞在补充有Glutamax和10％胎牛血清的DMEM中培养。人类患者来源的髓母细胞瘤和成胚细胞瘤细胞系PER547，逆转录病毒转导表达荧光素酶。短期GBM6细胞未被逆转录病毒修饰，。加入20 ng / mL的生长因子。对于所有实验，将细胞在37℃，5％CO2中培养。

　　在体外药敏试验

　　将达克替尼(多泽润)和活化形式的环磷酰胺4-氢过氧环磷酰胺溶于DMSO。硫酸长春新碱在盐水中提供。使用Microlab NIMBUS将细胞（5,000 /孔）铺在384孔板中。在DMSO中制备药物稀释液（如果是长春新碱，则用生理盐水稀释），然后在加入组合阵列矩阵的细胞中之前，在培养基中进一步稀释。将细胞处理72小时，并与阿拉玛蓝，使用Biotek Synergy Mx检测荧光，激发/发射波长分别为570 nm和590 nm，分别。将原始荧光数据标准化为在DMSO对照中测得的荧光，并表示为对照的百分比。从使用Prism v7（GraphPad Software）确定的最佳拟合剂量反应曲线中插值ED50（导致50％存活的有效剂量）和受影响的细胞因子。CompuSyn用于确定药物相互作用。

　　蛋白质提取和免疫印迹

　　将U87.Luc2，U87vIII.Luc2，Daoy.Luc2和452.Luc2细胞在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤两次，并在添加0.1％FBS的培养基中饥饿3.5小时，然后添加递增浓度的达科替尼。用400 nM，1或4μM达科替尼处理U87.Luc2和U87vIII.Luc2细胞。用6.25、25、100或400 nM达可替尼处理的Daoy.Luc2和452.Luc2细胞。加入达科替尼后30分钟，通过加入20 ng / ml重组人EGF刺激EGFR。在收获前，将GBM6细胞用500 nM dacomitinib处理过夜。在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液中裂解细胞。免疫印迹是使用特定的一抗进行的，然后是辣根过氧化物酶偶联的二抗，使用Supersignal West Dura进行检测，并在BioRad Chemidoc中进行可视化。使用的抗体是磷酸化EGFR（p-EGFR）Y1173，p-EGFR Y1068，总EGFR，磷酸化AKT（p-AKT）S473，泛AKT，磷酸化ERK1 / 2（pERK1 / 2）T202 / Y204，总ERK1 / 2，PTEN和β-肌动蛋白。

　　免疫荧光

　　将U87vIII.Luc2细胞接种到载玻片上，并在含有10％FBS的培养基中培养过夜。将细胞用DMSO（0.01％）或1μMdacomitinib处理16小时，然后固定在PBS中的4％多聚甲醛中。封闭细胞，并在室温下用含0.1％Triton X-100和10％正常山羊血清的PBS透化1小时。将细胞进一步与抗磷酸化EGFR Y1173一抗，然后与Cy3偶联的抗兔二抗一起孵育。使用DAPI对核进行染色，并使用VectorShield HardSet安装介质将玻片盖上盖玻片。使用Nikon Ti Eclipse和NIS Elements软件拍摄宽视野的落射荧光图像。

　　对于原位异种移植，将细胞悬浮在基质胶（BD Biosciences）中（106个细胞，总体积为5μL），并植入10-12周龄无胸腺雌性小鼠的右脑半球 ，珀斯，西澳大利亚州）使用汉密尔顿注射器。为了进行生存研究，每周使用IVIS Spectrum通过生物发光监测肿瘤大小。一旦建立了肿瘤（通过生物发光确定），就如文本中所示对小鼠进行治疗。Kaplan–Meier无肿瘤生存曲线是使用Prism v7根据植入后直至肿瘤引起需要安乐死的发病率天数生成的。

　　免疫组织化学（IHC）

　　将小鼠脑组织在PBS中的4％多聚甲醛中固定过夜，然后包埋在石蜡中。组织切片（5μm）在柠檬酸盐缓冲液中进行微波抗原回收，然后用以下抗体进行免疫染色：Ki-67（Leica＃NCL-Ki67p，1：5000），裂解的，p-EGFR Y1173，磷酸化ErbB4Y984（细胞信号编号3790，1:50）或总ErbB4（Santa Cruz＃SC-283，1：200） 。使用生物素化的二抗对切片进行显影，然后使用Elite ABC试剂盒和NovaRED过氧化物酶底物进行检测，然后用Gill的苏木精进行染色。使用Nuance光谱解混相机和InForm Tissue Finder软件（Perkin Elmer）对Ki67和CC3阳性细胞进行定量。

　　如适用，使用未配对的两尾学生t检验评估治疗组之间的统计学显着性。使用对数秩（Mantel-Cox）检验比较了Kaplan-Meier生存曲线。所有统计分析均使用GraphPad Prism v7进行，P<.05被认为是显着的。现在达克替尼的价格是多少？更多详情可咨询下方微信。