达拉非尼Dabrafenib对RIP3的抑制作用强

　　受体相互作用蛋白(receptor-interactionsprotein,RIP)3是一种重要的坏死调节因子，并已被证实与多种疾病相关，提示其抑制剂在临床上很有前景。然而，到目前为止，RIP3抑制剂的报道很少。B-RafV600E抑制剂是一种重要的转移性黑色素瘤的抗肿瘤药物。在本研究中，我们发现6种B-Raf抑制剂可以在体外抑制RIP3酶活性。其中，达拉非尼对RIP3的抑制作用最强，这是通过其atp竞争性结合酶实现的。达拉非尼对RIP1、RIP2和RIP5具有高度选择性的抑制作用。　　

　　此外，只有dabrafenib能够从rip3介导的坏死诱导组合(肿瘤坏死因子(TNF)α、TNF相关凋亡诱导配体或Fas配体+Smac模拟物和caspase抑制剂z-VAD)诱导的坏死中挽救细胞。达拉非尼降低了RIP3介导的混合血统激酶结构域样蛋白(mixedlineagekinasedomain-likeprotein,MLKL)Ser358磷酸化，并破坏了RIP3和MLKL之间的相互作用。　

　　值得注意的是，达拉非尼对RIP3的抑制似乎独立于其对B-Raf的抑制。达拉非尼进一步被发现可以预防对乙酰氨基酚诱导的正常人肝细胞坏死，这被认为是由RIP3介导的。在对乙酰氨基酚过量的小鼠模型中，达拉非尼可以明显减轻对乙酰氨基酚引起的肝损伤。结果表明抗癌B-RafV600E抑制剂dabrafenib是一种RIP3抑制剂，可作为探测RIP3生物学的利器，也可作为潜在的预防或治疗RIP3相关的坏死相关疾病，如对乙酰氨基酚引起的肝损伤。　

　　在本研究中，我们建立了一种非放射性RIP3激酶检测方法，并通过该方法发现，在8种Raf抑制剂中，达拉非尼对RIP3的抑制作用最强。通过ATP与酶蛋白的竞争性结合，达拉非尼相对于其他RIP家族成员具有高选择性地抑制了RIP3。达拉非尼显然可以从rip3介导的坏死中拯救细胞，而rip3介导的坏死与它的B-Raf抑制无关。此外，达拉非尼可减轻对乙酰氨基酚诱导的rip3介导的人肝细胞或小鼠肝组织坏死损伤。　　

　　rip3介导的坏死已被证实参与多种病理状态。RIP3基因敲除或沉默可以逆转或预防其中一些疾病或损伤，这表明RIP3抑制剂在临床中有潜在的预防或治疗用途。迄今为止，只有两种RIP3抑制剂被报道，但这两种抑制剂只是用于探测RIP3在tlr3诱导坏死中的作用；没有数据显示它们对rip3相关疾病或损伤的预防或治疗作用。因此，达拉非尼是目前报道的首个对RIP3介导的病理状态即对乙酰氨基酚诱导的肝损伤具有预防或治疗作用的小分子RIP3抑制剂。达拉非尼已被用于临床治疗其他疾病，表明其对人体的安全性是可以接受的。这显然增加了其用于预防或治疗rip3相关疾病或损伤的可能性，包括对乙酰氨基酚过量的肝毒性。　　

　　尽管RIP1和RIP3蛋白具有相似的一级序列，而且RIP1、RIP3和B-Raf蛋白具有相似的构象，我们的数据显示RIP1抑制剂necrostatin-1并没有抑制RIP3。测试的B-Raf抑制剂也表现出不同的RIP3抑制活性，这与它们的Raf抑制活性明显无关。达拉非尼对RIP3和Raf激酶均有明显抑制作用。此外，我们的数据显示，达拉非尼对RIP3的抑制独立于其对B-Raf家族成员的影响。　　

　　因此，根据dabrafenib的结构，仔细的构效关系研究有助于区分其抑制RIP3的部分和抑制Raf的部分。这一结果为今后开发高选择性RIP3或B-Raf抑制剂奠定了重要基础。选择性RIP3抑制剂除了可能用于RIP3相关病理状态外，还可以作为探针，探索RIP3在调节细胞死亡和相关信号转导过程中的作用。　　

　　此外，dabrafenib和vemurafenib最近都被批准用于B-RafV600E转移性黑色素瘤的治疗。达拉非尼对B-RafV600E的抑制作用是vemurafenib的39倍。然而，达拉非尼的临床疗效稍弱，皮肤鳞状细胞癌的发生率较低(达拉非尼III期临床试验的发生率为6%，而vemurafenibIII期临床试验的发生率为26%)，这是B-RafV600E抑制剂常见的副作用。　　

　　实验表明，达拉非尼Dabrafenib对RIP3的抑制作用也比vemurafenib强27倍。2种B-RafV600E抑制剂之间的这些差异似乎表明，RIP3抑制可能在它们的治疗效果和毒性中发挥作用，这一点值得澄清。在这方面，B-Raf对RIP3的选择性抑制剂可能也有帮助。　　

　　最后，我们在本研究中建立的发光RIP3激酶检测方法有几个优点。它具有与广泛使用的放射性RIP3激酶测定法相当的高灵敏度。它是非放射性的，因此没有潜在的放射性污染和风险。　　

　　该方法可以在一个相对较小的(10μl)系统中运行，以384孔板的格式，可以满足小分子化合物的高通量筛选的要求。本实验使用的重组RIP3是全长的人RIP3，这确保了化合物筛选结果与人类细胞或组织高度相关。此外，所有用于本试验的其他材料或试剂都是常见的，很容易在市场上买到。所有这些优点表明，本研究建立的RIP3激酶检测方法有可能在未来得到广泛应用。详情请扫码咨询：