所有研究均使用基因改造的Brca1Co / Co; MMTV-Cre; p53+/-小鼠的乳腺肿瘤衍生的W0069和W780细胞系。所有细胞均在补充有10％FBS和1％Penn / Strep的Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）中生长。为了评估和比较各种PARP抑制剂的功效，将W0069和W780用10 µM 奥拉帕尼，他拉唑帕尼（他唑帕尼）尼拉帕尼治疗24-72小时。用裂解的PARP（Upstate），裂解的caspase 3，γ-H2aX或α-微管蛋白的抗体处理细胞裂解液以进行蛋白质印迹。
计算IC 50值以确定细胞系对PARP抑制剂他拉唑帕尼，奥拉帕尼和尼拉帕尼的敏感性。将W0069和W780细胞以每孔1000个细胞接种到96孔板中。第二天，细胞用0至100nM的他拉唑帕尼浓度处理。接种后一周，用MTS测定法（Promega）测定细胞活力，以测定细胞的代谢活性。绘制剂量响应，并使用变量斜率四参数对数方程（约束为0）进行拟合，以确定IC50值（Prism）。所有实验均重复三次。
使用HPLC研究了他拉唑帕尼从植入物中的释放特性。为了确定释放动力学，将他拉唑帕尼植入物切成预定长度，进行测量，并将其置于37℃下的1ml PBS（用1N HCl调节的pH 6.0）中，轻轻摇动以模拟生物肿瘤状况28天。在每个预定的时间点，将缓冲液完全去除，并用新鲜的缓冲液替换，以保持药物贮存库和缓冲液之间的浓度梯度。如先前所述，对每个收集的缓冲液部分进行HPLC分析，并对释放的塔拉唑帕尼进行定量。注意在缓冲液转移过程中不要搅动和破坏垫片的完整性。28天后，将间隔物溶解，并对所有剩余药物进行定量。将释放并保留在间隔物中的总药物求和，并与给定长度的间隔物的HPLC分析得出的估计载药量进行比较。将植入物释放的药物绘制成时间的函数。
所有动物研究均根据达特茅斯学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。为了进行体内治疗效果评估，使用了两种不同长度的他拉唑帕尼植入物。将单位剂量相同的他拉唑帕尼制成的植入物切成两种不同的长度，分别为1 mm和2 mm。由于他拉唑帕尼植入物中的载药量为25μg/ mm，因此1和2 mm长的植入物分别分别包含25和他拉唑帕尼。在体内治疗他拉唑帕尼植入物中的基因工程进行的功效BRCA1基因CO / CO2; MMTV-Cre重组; p53的+/-乳腺癌小鼠模型。当肿瘤大小约为直径4-6 mm时，开始进行小鼠治疗。使用18G近距离放射治疗涂药针在瘤内施用他拉唑帕尼植入物。对于肿瘤内植入，将他拉唑帕尼植入物预加载到敷料针中，并横向引导至肿瘤中心。当从肿瘤中拔出外针时，通过同时按压探针来弹出植入物。动物皮肤胶被用来密封皮肤上的小孔，以避免植入物从肿瘤中泄漏出来。在研究中使用了四组动物。
对照组接受瘤内植入空白PLGA植入物（他拉唑帕尼），通过口服管饲法，用游离的他拉唑帕尼治疗另外一个对照组，并用单个1 mm或2 mm长的植入物治疗两个他拉唑帕尼植入物组。口服给予他拉唑帕尼，以与目前的临床治疗方法进行比较。在12天的期间内，每隔一天通过口服管饲法给予等效剂量的游离他拉唑帕尼总计六次（每管饲法8.3µg）。使用卡尺监测肿瘤大小，每周两次称重小鼠以评估体重减轻。
使用以下公式计算肿瘤体积：体积＝长×宽×高/ 2。如果肿瘤直径超过1 cm，肿瘤体积超过体重的10％，或者肿瘤溃烂或干扰活动性，则处死小鼠。为了进行免疫组织化学，收集了肿瘤，固定在中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中并切成薄片。如前所述，将切片用PCNA或γ-H2aX抗体染色3。为了确定PCNA-或γ-H2aX阳性细胞的百分比，对每个肿瘤外围的两个切片进行计数（n = 4-5 /次治疗，每个〜1000个细胞）。将载玻片随机分组，并在计数前除去组标签。现在他拉唑替尼价格多少钱？更多详情可咨询下方微信。
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