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卡博替尼Cabozantinib的药效性研究

时间:2021-04-08 13:23 来源:康安途 作者:康安途出国看病

  卡博替尼(Cabozantinib)和雷戈非尼治疗后,通过18-氟-脱氧葡萄糖正电子发射断层显像(FDG-PET)测量葡萄糖摄取。在2种CRC PDX模型(CRC098和162)上进行了FDG-PET研究,以确定治疗是否改变了葡萄糖的摄取。在基线(治疗之前)以及在用卡巴替尼或雷戈非尼治疗后的第7天和第28天对动物进行扫描。小鼠禁食4小时,并通过尾静脉注射150μCi(5.55 MBq)的18F-氟脱氧葡萄糖(FDG,通过PetNet获得)。进行。首先,执行快速CT扫描以进行解剖定位。然后,将床移至μPET扫描仪中。所有PET扫描均以双采样模式获取,以提高空间分辨率(1.2毫米)。西门子Inveon工作站研究(IWR v3)进行了PET / CT图像融合,以精确解剖识别感兴趣区域(ROI)。在肿瘤病变内手动绘制感兴趣区域,并确定ROI的总放射性(以kBq / mL为单位)。SUV是按照我们小组和其他人的描述计算的。所有PET / CT扫描均在UCCC动物影像共享资源(AISR,N。Serkova)处进行。

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  使用RNAeasy试剂盒(Qiagen)提取在治疗第3天来自卡博替尼治疗的CRC外植体的总RNA。RNA Seq用于确定对照小鼠和治疗小鼠肿瘤中的基因表达。原始表达值已获得,并通过Affymetrix Power Tools基于多阵列平均值进行标准化。代表同一基因的多个探针组以最大值折叠。为了评估对照和卡博替尼处理的外植体中富集的途径,

  使用Qiagen组织裂解仪将对照和治疗的肿瘤标本(15 mg /肿瘤组织)均质化。在冰上10分钟后,将裂解的组织在4℃以16,000g离心10分钟。使用660 Protein Assay试剂盒定每个样品中的蛋白质定量。在预制的4–12%Bis-Tris凝胶(Life Technologies)上对总共50μg的样品进行电泳。然后使用iBlot转移系统(Life Technologies)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。使用3%酪蛋白在室温下将膜封闭1小时。封闭后,将膜与以下一级抗体(1:1,000)在4°C下摇动过夜:(磷酸化和总计:MET,AKT,己糖激酶,丙酮酸脱氢酶,ULK1,ATG3,Beclin,LC3,SQSTM / p62和肌动蛋白(细胞信号技术)。用TBST洗涤3次后,将膜与抗兔IgG(H + L)二抗在室温下孵育1小时,最终稀释度为1:15,000。使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor)捕获信号图像。

  使用Qiagen组织裂解仪将对照和处理过的肿瘤标本(15 mg /肿瘤组织)均质化,并使用660 Protein Assay试剂盒对蛋白质进行定量。将含有39抗体/孔的载玻片(RTK阵列; Cell Signaling Technologies)封闭15分钟后,将50μg蛋白加入到载玻片中,并在4°C温和摇动孵育过夜。然后洗涤载玻片,并向载玻片中添加检测抗体,然后加入DyLight 680VR连接的链霉亲和素。使用Odyssey红外成像系统(Li-Cor)捕获幻灯片图像,并使用Odyssey系统软件对其进行定量。

  使用CYTO-ID®自噬检测试剂盒(Enzo -ENZ-51031-K200)在HCT116和HT29细胞系上评估了卡博替尼,雷戈非尼和克唑替尼对自噬的治疗效果。将HCT116或HT29细胞以1,000个细胞/孔的浓度接种在96块黑色壁板中。24小时后,将细胞用卡博替尼(5μM),瑞戈非尼(5μM)和克唑替尼(1μM)处理。孵育24小时后,将细胞用1x分析缓冲液洗涤2次,然后与CYTO-ID®自噬检测试剂一起孵育30分钟。30分钟后,将细胞用1x分析缓冲液洗涤2次。使用488nm激发绿色荧光检测在IncuCyte™ZOOM活细胞成像仪上评估了治疗效果。

  接下来,我们在体外进行与自噬抑制剂氯喹和/或SBI-0206965(ULK1抑制剂)在HCT116和HT29 CRC细胞上的联合研究。将细胞以1,000个细胞/孔的浓度接种在96黑孔板中,并孵育过夜以使细胞粘附。24小时后,除去培养基,并向每个孔中添加100 ul含有IncuCyte™动力学Caspase-3 / 7细胞凋亡测定试剂(目录号4440)的培养基。用卡博替尼(5μM),SBI-0206965(5μM),氯喹(10μM),卡博替尼(5μM)加SBI-0206965(5μM)和卡博替尼(5μM)加氯喹(10)处理细胞后立即(μM)。此外,将瑞戈非尼(5μM)或克唑替尼(1μM)用作单一药物,并与SBI-0206965(5μM)组合使用。现在卡博替尼的仿制药价格是多少?更多详情可咨询下方微信。

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(责任编辑:康安途海外就医)

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