艾曲波帕/瑞弗兰在髓样白血病细胞中试验方法详情

　　试剂和细胞培养

　　艾曲波帕（瑞弗兰,SB-497115-GR，SB497115）购自Selleck Chemicals，溶于二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma），地西他滨购自山东齐鲁药业有限公司（中国）。人髓样白血病细胞系（K562和THP-1）购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC），并在含有10％胎牛血清（FBS，SeraPro，德国）的RPMI 1640培养基（HyClone，美国）中培养。 1％青霉素/链霉素（中国武汉武汉生物技术有限公司），并在5％CO2和37°C下孵育。

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　　药物治疗

　　白血病细胞系用2.5、5、10或30μg/ mL EP或0.5、5、10或20μmol/ L DAC单一试剂培养24、48、72或96小时。对于组合治疗，在以下两种组合中同时在两个细胞系中使用EP和DAC：2.5μg/ mL EP与20μmol/ L DAC，5μg/ mL EP与20μmol/ L DAC，10μg/ mL EP使用20μmol/ L DAC时，使用30μg/ mL EP时使用20 umol / L DAC。

　　细胞活力分析

　　细胞计数试剂盒8（CCK-8）（日本道金多）用于检测白血病细胞的活力。将白血病细胞悬液（100μL，5×104细胞/ mL）添加到96孔板中。从第0天开始，将不同浓度的单独的DAC和EP或如上所述的组合添加到培养基中，并将细胞在培养箱（37℃，5％CO2）中处理72小时。在测试细胞活力之前，将10μLCCK-8加入每个孔中。将板孵育2小时。然后，通过酶标仪（Rayto，美国）在450nm下记录吸光度。细胞存活率（％）如下计算：（OD450样品-OD450空白）/（OD450对照-OD450空白）×100％。

　　细胞凋亡测定

　　用EP，DAC和EP加DAC处理白血病细胞系72小时，然后通过离心收集5×105个细胞。用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Servicebio，中国）洗涤细胞，并重悬于500μL1x结合缓冲液中。将细胞与5 µL膜联蛋白V-FITC和5 µL碘化丙啶（PI）在黑暗（室温）中孵育5分钟。然后，使用流式细胞仪（Beckman，USA）分析激发波长（Ex）＝ 488nm和发射波长（Em）＝ 585±21nm的白血病细胞凋亡。凋亡细胞由膜联蛋白V阳性和PI染色阴性的早期凋亡细胞和对膜联蛋白V和PI双重阳性的晚期凋亡细胞组成。

　　细胞周期分析

　　白血病细胞系用EP，DAC和EP加DAC处理72小时，然后收集白血病细胞并将其重悬于PBS中。接下来，将75％的冷乙醇加入细胞，并将细胞在冰上固定过夜。用PBS洗涤细胞，并重悬于具有50μg/ mL PI和PBS（包括100μg/ mL RNase A）的染色缓冲液中。将上述悬浮液在4℃下孵育（过夜）。使用流式细胞仪获得有关细胞周期分布的数据。使用FlowJo软件分析细胞周期分布。

　　ROS分析

　　在不同浓度的EP和/或DAC下培养白血病细胞系72小时。然后收集白血病细胞并重悬于PBS中。将细胞浓度调节至1×106-2×108细胞/ mL。将细胞在37°C下用10 µM DCFH-DA染色20分钟，然后每3-5分钟混合并倒置。染色的白血病细胞用PBS洗涤一次，并通过流式细胞术分析信号在Ex = 488 nm和Em = 585±20 nm的信号。

　　统计分析

数据通过GraphPad Prism 7.0评估。所有统计分析均至少进行了3次生物学重复测试，并显示为平均值±SD。通过t检验（和非参数检验）对不同组进行统计学比较。当p值<0.05时，考虑统计学上的显着差异。最后可发现EP和DAC对髓样白血病细胞的协同抗白血病作用。现在艾曲波帕价格是多少？更多详情可咨询下方微信。

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