ponatinib普纳替尼通过抑制RIPK1和RIPK3活性来阻断坏死性凋亡

　　鉴于RIPK1，RIPK3和MLKL在坏死的诱导，互动，载我们去评估哪些人构成普纳替尼的直接目标。为了测试普纳替尼对假激酶MLKL的抑制作用，我们产生了HT-29细胞，该细胞在强力霉素处理后表达组成型活性MLKLS358D突变体。MLKLS358D表达的诱导导致细胞死亡，这可以被MLKL抑制剂necrosulfonamide(NSA)阻断。　

　　相比之下，ponatinib不能阻止由MLKLS358D表达驱动的细胞死亡，强烈表明该蛋白质不是直接的药物靶点。接下来，我们通过监测诱导坏死性凋亡时的磷酸化状态来评估ponatinib对RIPK1和RIPK3的影响。在TSZ处理的HT-29细胞中，RIPK1、RIPK3和MLKL的时间依赖性磷酸化被普纳替尼阻断。事实上，竞争性结合测定证实普纳替尼直接可以结合RIPK1我Ñ体外以高亲和性（ķd：37纳米）。在激酶测定中评估了ponatinib和其他BCR-ABL抑制剂对重组RIPK1和RIPK3催化活性的影响。　　

　　Ponatinib强烈阻断通用底物髓鞘碱性蛋白(MBP)的磷酸化，表明对两种激酶都有抑制活性。与在高药物浓度下在FADD缺陷的Jurkat细胞中观察到的保护作用一致，达沙替尼也与RIPK3活性在所测试（10浓度干扰 μM）。普纳替尼阻断重组RIPK3与IC50为0.64 μM在该激酶试验。我们进一步监测了RIPK3自磷酸化，其被ponatinib有效阻断，而RIPK1抑制剂Nec-1s没有显示效果。考虑到细胞活力和这些体外激酶测定所观察到的不同IC50值，我们着手验证细胞中的内源性RIPK3是否以本研究中使用的浓度(0.5μM)为靶点 。　　

　　为此，我们进行了细胞热位移测定(CETSA)，监测由药物结合引起的蛋白质稳定性。事实上，ponatinib治疗导致RIPK3热稳定性曲线发生变化，表明目标参与。此外，与Nec-1相比，ponatinib能够阻止由RIPK3或MLKL过表达诱导的MLKL磷酸化。与这些结果一致，ponatinib有效地阻断了RIPK3与MLKL的结合。　　

　　这些数据证明了ponatinib能够直接靶向RIPK1和RIPK3，这是坏死性凋亡信号传导的两个关键介质。除了帕唑帕尼直接结合(Kd=260nM)50并抑制RIPK1激酶活性，它不阻断MLKLS358D驱动的坏死性凋亡，并且仅适度影响重组激酶测定中的RIPK3活性。与Nec-1类似，帕唑帕尼阻断了TSZ诱导的MLKL磷酸化，而当MLKL磷酸化由RIPK3或MLKL过表达触发时，它只有很小的影响。详情请扫码咨询：