达拉非尼(dabrafenib)可预防对乙酰氨基酚诱导肝细胞死亡

　　受体相互作用蛋白(RIP)3是一种重要的坏死调节蛋白，并已被证明与各种疾病相关，表明其抑制剂在临床上很有前景。然而，目前报道的RIP3抑制剂很少。B-RafV600E抑制剂是一种重要的转移性黑色素瘤治疗抗癌药物。在本研究中，我们发现6种B-Raf抑制剂可以在体外抑制RIP3酶活性。其中，达拉非尼（dabrafenib）对RIP3的抑制作用最强，这是通过与酶的atp竞争结合实现的。达拉非尼对RIP3比RIP1、RIP2和RIP5表现出高度选择性抑制。此外，只有达拉非尼（dabrafenib）挽救了由坏死因子(TNF)α、TNF相关凋亡诱导配体或Fas配体+ Smac模拟物和caspase抑制剂z-VAD联合诱导的rip3介导的坏死。达拉非尼（dabrafenib）降低了RIP3介导的混合谱系激酶域样蛋白(MLKL)的Ser358磷酸化，并破坏了RIP3和MLKL之间的相互作用。值得注意的是，dabrafenib对RIP3的抑制似乎独立于其B-Raf抑制。进一步发现Dabrafenib可预防对乙酰氨基酚诱导的正常人肝细胞坏死，这被认为是由RIP3介导的。在对乙酰氨基酚过量的小鼠模型中，发现达非尼能明显缓解对乙酰氨基酚引起的肝损伤。结果表明，抗癌B-RafV600E抑制剂达拉非尼（dabrafenib）是一种RIP3抑制剂，可作为探索RIP3生物学的利器，并可作为潜在的预防或治疗RIP3参与的坏死相关疾病，如醋氨酚引起的肝损伤。

　　在本研究中，我们建立了一种非放射性RIP3激酶检测方法，发现在8种测试的Raf抑制剂中，dabrafenib对RIP3的抑制作用最强。通过ATP与酶蛋白的竞争性结合，达拉非尼（dabrafenib）相对于其他RIP家族成员具有较高的选择性抑制RIP3。达拉非尼（dabrafenib）显然挽救了rip3介导的坏死，这与它的B-Raf抑制无关。此外，达非尼缓解了醋氨酚诱导的rip3介导的人肝细胞或小鼠肝组织坏死损伤。

　　rip3介导的坏死已被证实参与多种病理状态RIP3敲除或沉默可以逆转或预防某些疾病或损伤，这表明RIP3抑制剂在临床上有潜在的预防或治疗用途。目前报道的RIP3抑制剂只有两种(GSK'843和GSK'872)，20种，但这两种抑制剂只是用于探索RIP3在tlr3诱导坏死中的作用;没有数据显示它们对rip3相关疾病或伤害的预防或治疗作用。因此，dabrafenib是第一个报道的RIP3小分子抑制剂，在RIP3介导的病理状态，即醋氨酚诱导的肝损伤中具有预防或治疗作用。Dabrafenib已被用于临床的其他疾病，表明其对人类的安全性是可以接受的。这显然提高了其预防或治疗性临床应用于与rip3有关的疾病或损伤，包括对乙酰氨基酚过量肝毒性的可能性。

　　虽然RIP1和RIP3蛋白具有相似的一级序列，而且RIP1、RIP3和B-Raf蛋白具有相似的构象，21我们的数据显示RIP1抑制剂坏死抑制素-1不能抑制RIP3。被检测的B-Raf抑制剂也表现出不同的RIP3抑制活性，这与它们的Raf抑制活性明显无关。Dabrafenib对RIP3和Raf激酶均有抑制作用。此外，我们的数据显示，达拉非尼（dabrafenib）抑制RIP3独立于其对B-Raf家族成员的影响。因此，基于达拉非尼（dabrafenib）的结构，仔细的构效关系研究有助于区分其抑制RIP3的部分和抑制Raf的部分。这一结果可能为未来开发高选择性的RIP3或B-Raf抑制剂奠定重要基础。选择性RIP3抑制剂除了可能应用于RIP3相关的病理状态外，还可以作为探针来探索RIP3在调控细胞死亡及相关信号转导过程中的作用。

　　此外，达拉非尼（dabrafenib）和vemurafenib最近都被批准用于治疗含有B-RafV600E.29的转移性黑色素瘤Dabrafenib对B-RafV600E的抑制能力是vemurafenib的39倍。然而，dabrafenib的临床治疗效果较弱，导致皮肤鳞状细胞癌的发生率较低(在dabrafenib III期试验中发生率为6%，而在vemurafenib III期试验中发生率为26%)，这是B-RafV600E抑制剂的常见副作用根据荧光分析，达拉非尼（dabrafenib）抑制RIP3的能力也比vemurafenib强27倍(表1)。两种B-RafV600E抑制剂之间的这些差异似乎表明，RIP3抑制可能在它们的治疗效果和毒性中发挥作用，这一点值得澄清。在这方面，针对RIP3的选择性B-Raf抑制剂可能也有帮助。

　　最后，我们在本研究中建立的发光RIP3激酶检测方法有几个优点。它具有与广泛使用的放射性RIP3激酶测定相当的高灵敏度。它是非放射性的，因此没有潜在的放射性污染和风险。该分析可以在一个相对较小的系统(10 μl)中以384孔板格式运行，可以满足小分子化合物的高通量筛选要求。本实验使用的重组RIP3是全长人RIP3，确保了化合物筛选结果与人细胞或组织的高度相关性。此外，在本分析中使用的所有其他材料或试剂都是常见的，而且很容易在商业上获得。所有这些优点表明，本研究建立的RIP3激酶检测方法有可能在未来得到广泛应用。微信扫描下方二维码了解更多：