克唑替尼(Crizotinib)耐药性研究

　　已经在各种类型的人类癌症中鉴定出各种形式的致癌ALK蛋白。虽然已发现一种ALK抑制剂克唑替尼（Czozotinib）可治疗部分ALK+肿瘤，但对该药物的临床耐药性已得到公认，并且对该现象的机理尚不完全清楚。使用细胞热位移分析（CETSA），我们在一组ALK+细胞系中测量了Crizotinib-ALK结合，并将发现与ALK结构及其与特定结合蛋白的相互作用相关联。克唑替尼IC50与克唑替尼-ALK结合显着相关。克唑替尼耐药细胞中次佳的克唑替尼-ALK结合不是由于细胞特异性环境引起的，因为NPM-ALK进入这些细胞后，显示出大量的Crizotinib-NPM-ALK结合。有趣的是，我们发现耐药细胞表达了更高的β-catenin蛋白水平，siRNA敲低恢复了Crizotinib-ALK结合（与IC50的显着降低有关）。晶体结构的计算分析表明，β-连环蛋白对克唑替尼-ALK结合起位阻作用。总之，可通过CETSA测量的Crizotinib-ALK结合可用于预测Crizotinib的敏感性，而Crizotinib-ALK的结合又由ALK及其一些结合伴侣的结构决定。

　　克唑替尼是临床上第一种使用的ALK抑制剂，它已显示出对小鼠模型以及人类中出现的ALK+肿瘤的显着疗效。例如，克里唑替尼已经显示出显着的抗肿瘤活性在复发ALK+ALCL患者。然而，尽管已显示克唑替尼在治疗ALK+NSCLC患者方面具有治疗效果，但许多接受治疗的患者在治疗后的一年内均显示出疾病进展。近期的许多研究表明，克唑替尼的治疗益处在不同类型的ALK+癌症之间存在差异。对克唑替尼的不同临床反应的潜在机制尚不清楚。患者小队列初始研究已经表明，内的突变ALK激酶结构域可以驱动到克里唑替尼的获得性抗性。在NSCLC中，虽然最初报道EML4-ALK表达细胞中的克唑替尼敏感性差异与四种EML4-ALK融合变体的存在有关，但随后的研究结果并未证实这些EML4-ALK变体之间的关系和克里唑蒂尼的反应。在一项1期临床试验中，在ALK队列中发现了广泛的Crizotinib反应性+神经母细胞瘤患者。综上所述，对克唑替尼的抗药性在临床上仍然是一项重大挑战，而对这种特定药物抗性的潜在机制尚不完全清楚。

　　特定ALK抑制剂的出现和应用已显着改善了ALK+肿瘤患者的临床结局，其中包括（最值得注意的是）ALK+ALCL和ALK+肺癌。克唑替尼是ALK抑制剂中的第一种。两个临床研究中，克里唑替尼作为单独的药剂已经在复发ALK所示显着的抗肿瘤活性+ALCL患者。不幸的是，基于一些其他的临床研究的结果，对ALK抑制剂的抗性相对经常发生。虽然潜在的克唑替尼耐药机制尚不完全清楚，但克唑替尼诱导的继发性突变的获得被认为是重要的因素。除了ALK突变，以ALK抑制剂的抗性的其它机制包括ALK基因扩增和替代存活信号传导途径如KRAS和EGFR的活化。迄今为止，克服酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的选择相对较少。关键策略是开发新一代的ALK抑制剂，希望这些药物可以通过不受突变影响的替代位点与ALK结合。然而，这些新的抑制剂的效力是不相符也不可预测。

　　来自该研究的结果与先前的观察，即克唑替尼的敏感性是ALK中是高度可变协议+人癌细胞。使用7组ALK+在克唑替尼敏感性高度可变的细胞系中，我们研究了克唑替尼耐药性的生物学基础。我们研究的重要发现是克唑替尼敏感性与克唑替尼-ALK结合之间存在显着相关性。使用52°C作为CETSA分析的临界值，我们发现所有3种对Crizotinib敏感的细胞系均表现出Crizotinib-ALK结合，而与4种抗性细胞系均无相反，包括携带野生型抗性的两种细胞系。键入ALK（IMR32和GOTO）。与以前发表的大多数克唑替尼耐药性研究不同，后者主要研究ALK突变与体外反应之间的相关性。对克唑替尼敏感，这项当前研究提供了直接的证据，突出了克唑替尼和ALK之间的物理相互作用作为克唑替尼敏感性的关键决定因素的重要性。可以看出，克唑替尼和ALK之间的相互作用可能受到至少三个主要因素的调节：（1）细胞类型特异性的总体生化和生物学状态；（2）ALK的3维结构，进而受到ALK基因突变及其与其他基因异常融合的强烈影响；（3）ALK及其结合蛋白之间的相互作用，进而受ALK与特异性结合蛋白之间的相对亲和力以及特异性ALK结合蛋白的表达水平的影响。

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