乐伐替尼/乐卫玛对抗肿瘤活性的试验数据

　　源自CCCL小鼠中BW7756肿瘤的Hepa1-6细胞是从ATCC获得的。将细胞在高葡萄糖DMEM中培养，该培养基中添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素。在5％CO2气氛下为37°C。乐伐替尼（乐卫玛）在Eisai合成。索拉非尼购自Bayer Yakuhin。抗小鼠PD-1 Ab（抗PD-1 Ab;克隆RMP1-14），抗小鼠CD8αAb（抗CD8 Ab;克隆YTS 169.4）和小鼠同种型对照IgG）购自Bio X Cell。

　　将Hepa1-6细胞按1-2×103个细胞/孔接种在96孔板上，并在5％CO2气氛下于37°C下培养。第二天，将细胞用乐伐替尼或索拉非尼（0.01-30μmol/ L）处理并培养3天。通过使用Cell Counting Kit-8和SpectraMax 190 Microplate Reader和捆绑的SoftMax Pro软件来确定细胞活力。波长为450 nm。通过使用GraphPad Prism 7软件确定IC50值。将Hepa1-6细胞（4×106细胞）皮下植入从杰克逊实验室或CAnN购买的8-10周龄C57L / J小鼠的右侧腹。

　　nu/ CrlCrlj小鼠购自日本Charles River Laboratories日本。当肿瘤的体积达到约100 mm3时，将小鼠随机分为每个治疗组，然后将乐伐替尼和乐卫玛，然后用蒸馏水30倍稀释4倍每天通过口服管饲法给药）。每周两次腹膜内施用Anti-PD-1 Ab（200μg/头）。在确认每种化合物和同种型对照IgG的溶媒溶液没有任何抗肿瘤活性并且与未治疗相当后，将未治疗作为对照组。

　　开始治疗的日期指定为第1天。相对肿瘤体积（RTV）的计算如下：RTV = TVt / TV1，其中TVt是治疗开始后第t天的体积，TV1代表第1天的体积。ΔT/ C（％ Δ增长的对照）的计算公式如下：（ΔT/ΔC）×100，其中ΔT和ΔC分别是药物治疗和未治疗对照组的TV变化（Δ增长）。相对体重作为平均体重的比值计算。给定时间点的体重等于开始给药时的平均体重。为了进行流式细胞术（FCM）分析和单细胞分析，在第8天收集了肿瘤组织。所有动物实验均按照卫材机构动物护理和使用委员会批准的指导原则进行。显示的所有动物实验数据代表至少2个独立实验。

　　通过使用肿瘤解离试剂盒和温和的MACS解离器，将从小鼠切除的肿瘤组织解离为单个细胞。在细胞混合物中，使用OctoMACS分离器用小鼠CD45（TIL）微珠分离出CD45阳性的白细胞。洗涤和过滤后，将细胞用Mouse BD Fc阻断剂封闭，并用Ab板和DAPI（4'，6-二dia基-2-苯基吲哚；同人堂）。

　　如针对FCM分析所述，在肿瘤解离并分离出CD45+细胞后，将分离出的细胞以相同数量合并（每组n = 3）。在具有高输出试剂盒的NextSeq 500系统上进行文库的测序。Cell Ranger Suite用于执行样品多路分解，条形码处理和单细胞基因唯一分子标识符（UMI）计数。将来自4个样本的基因细胞条形码矩阵合并为1个矩阵，用于数据质量控制和下游分析。然后，我们排除了<3个细胞中检测到的12 094个基因。为了滤除低质量的细胞，排除了线粒体读取率> 10％或检测到的基因数量<500或> 5000的151个细胞。最终，选择了15 904个基因和7456个细胞用于下游分析。将每个单元格的UMI计数通过总UMI计数进行标准化，再乘以10000的比例因子，然后进行对数转换。为了降低数据的维数，对归一化的UMI计数进行了基于Seurat检测到的914个可变基因的主成分分析。tSNE分析基于主成分分析获得的前50个特征进行细胞和细胞的聚类。簇特异性标记基因通过2条标准进行鉴定：在特定簇中> 50％的细胞中检测；单元格中归一化的UMI计数是剩余单元格中的> 2倍。

　　实验数据表示为平均值±SEM。n是进行的独立实验的次数。分别通过Dunnett的多重比较检验，Sidak的多重比较检验和Fisher的精确检验对RTV，ΔT/ C和客观反应频率（CR + PR）的数据进行了比较分析。GraphPad Prism 7软件用于所有统计分析。P值<.05被认为具有统计学意义。现在乐伐替尼的价格多少？更多详情可咨询下方微信。