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奥希替尼治疗降低PC-9细胞的SPRY4水平

时间:2020-09-23 17:17 来源:康安途 作者:康安途海外就医

  egfr突变的NSCLC细胞,包括PC-9细胞,对第三代EGFR-TKI奥希替尼高度敏感。由于口服80mg奥希替尼后,患者血浆Cmax为635.4nM,我们认为1华时M或更少是奥希替尼的临床相关浓度。然而,大约有20-30%的中冲细胞存活,即使治疗高浓度(1μM)的奥希替尼72h,以确定这些细胞的机制逃脱奥希替尼的影响,我们评估phospho-kinases中冲细胞治疗或不使用phospho-kinase奥希替尼72h抗体阵列。我们发现,在奥希替尼处理后,HER3、MET和AXL等分子的磷酸化增加。奥希替尼治疗降低PC-9细胞的SPRY4水平吗?

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  因此,我们推测对奥希替尼的耐受可能是由这些蛋白的生存信号引起的。动力学分析显示,虽然在4h时,奥希替尼显著抑制了EGFR的磷酸化,但在72h时,EGFR又被明显地重新激活。奥希替尼在4h时也抑制了HER3和MET的磷酸化,但在24h时这些蛋白的磷酸化被重新激活,并在72h后重新激活逐渐增加。另一方面,虽然AXL未发生组成性磷酸化,但奥希替尼在4h诱导其磷酸化,并在72h后磷酸化水平升高。EGFR下游分子ERK的磷酸化被奥希替尼在4h显著抑制,并维持到72h。相反,另一个EGFR信号下游分子AKT在4h时被奥希替尼轻微抑制,并在24h时被重新激活。这些结果表明,奥希替尼暴露可能激活了PC-9细胞中的AXL,从而重新激活了HER3、MET和EGFR。

  奥希替尼治疗降低PC-9细胞的SPRY4水平吗?接下来,我们检测了HER3、MET和AXL敲除对EGFR中缺失19外显子和T790M突变的PC-9和PC-9GXR细胞存活率的影响。在没有奥希替尼的情况下,使用特异性siRNAs敲除HER3、MET和AXL可导致PC-9和PC-9GXR细胞存活率分别被抑制30-40%、25%和不到20%。奥希替尼抑制PC-9和t790m阳性PC-9GXR细胞的活性50%,这与它作为第三代EGFR-TKI的活性一致。在奥希替尼存在72小时后,敲除MET并不影响细胞存活率,而敲除HER3或AXL则进一步降低PC-9和PC-9GXR细胞的存活率约为20%。

  这些结果表明,AXL和HER3可能促进了EGFR突变的非小细胞肺癌细胞的存活,这些细胞的EGFR信号在奥希替尼暴露72小时后受到抑制。与奥希替尼相比,用EGFR特异性的siRNA处理PC-9和PC-9GXR细胞时,细胞存活率降低了25-30%。敲除HER3也降低了25-30%的细胞存活率,但敲除AXL仅略微降低了细胞存活率。这些结果与先前的发现一致,即EGFR和HER3的异二聚作用有助于维持EGFR突变的NSCLC细胞的致癌信号通路。在这些实验条件下,与单敲除EGFR相比,EGFR和AXL或HER3的双敲除均表现出更大的细胞存活率下降。有趣的是,HER3和AXL的双重敲低与EGFR和AXL的双重敲低同样有效地降低了细胞存活率,这表明AXL和EGFR或HER3之间存在相互作用。

  接下来,我们检测了这些分子在PC-9细胞中的磷酸化状态,无论是否下调了AXL或HER3。用特异性siRNAs处理PC-9细胞时,有效地抑制了AXL或HER3的蛋白表达。在对照组siRNA处理的PC-9细胞中,奥希替尼暴露72h仅轻微抑制了EGFR的磷酸化,可能是由于重新激活所致。有趣的是,在用siRNA处理的PC-9细胞中,同样72小时的奥希替尼治疗也极大地抑制了EGFR和HER3的磷酸化。在用siRNA处理HER3的PC-9细胞中没有观察到这种现象。免疫沉淀后的免疫印迹显示,奥希替尼治疗72小时后增强了AXL与HER3和EGFR的结合,但没有增强HER3与EGFR的结合。这些结果表明,在PC-9和PC-9GXR细胞中,奥希替尼激活了AXL,并维持了细胞的存活,可能是通过与EGFR和HER3相互作用。

  为了评估奥希替尼对AXL磷酸化的不利激活的机制,我们研究了从ERK到sprouty(SPRY)家族蛋白的负反馈回路的参与,这可以抑制不同受体酪氨酸激酶的磷酸化。奥希替尼治疗降低PC-9细胞的SPRY4水平。使用特异性siRNA敲除SPRY4可增加磷酸化AXL的表达。相比之下,过表达SPRY4维持了暴露于奥希替尼的PC-9细胞磷酸化AXL的表达水平。这些结果表明,奥希替尼通过关闭对SPRY4的负反馈回路,抑制了AXL的磷酸化,至少部分地对AXL产生了不利的激活。奥希替尼多少钱一盒?奥希替尼可以从国外邮寄吗,一次可以邮寄几盒?详情请扫码咨询:

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(责任编辑:康安途海外就医)

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